Metodo per la Determinazione di Aflatossina B1 in mais e

Metodo Per La Determinazione Di Aflatossina B1 In Mais E-Free PDF

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1 SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE 3,2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI 3. 3 RIFERIMENTI NORMATIVI E BIBLIOGRAFICI 3,4 PRINCIPIO DEL METODO 4. 5 REAGENTI E MATERIALE DI RIFERIMENTO 4,6 APPARECCHIATURE E MATERIALI 5. 7 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE 6,8 PROCEDURA 6,9 PROCEDURA DI SPIKING 7. 10 ANALISI HPLC 7,11 CALCOLI 9, 12 CRITERI DI APPROVAZIONE SCARTO DEI RISULTATI 10.
13 ESPRESSIONE DEL RISULTATO 11,14 INCERTEZZA 11,15 APPENDICE 1 CROMATOGRAMMI 13. 1 SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE, La presente procedura specifica il metodo per la determinazione della aflatossina B1 AFB1 contenuta. in campioni di mais e mangimi Il metodo prevede la purificazione con colonnine di immunoaffinit e. l analisi strumentale con cromatografia liquida ad alta risoluzione HPLC e rivelazione. spettrofluorimetrica Questo metodo stato sottoposto alla validazione con uno studio interlaboratorio. su campioni di mais e alla validazione interna su campioni di mangimi. Il metodo stato validato nell intervallo di concentrazione compreso fra 0 06 e 17 57 g kg per il mais. e tra 0 51 e 21 07 g kg per i mangimi,2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI. 2 1 Questo metodo richiede l uso di soluzioni standard di riferimento di aflatossina B1 La aflatossina. B1 genotossica ed attualmente classificata dallo IARC nel gruppo 1 devono pertanto essere. indossati guanti di protezione e tutte le fasi di preparazione di materiali di riferimento e campioni. devono essere condotte sotto cappa, 2 2 La aflatossina B1 soggetta a degradazione per effetto della luce solare diretta Pertanto. necessario proteggere adeguatamente il piano analitico di lavoro dalla luce del giorno e mantenere. le soluzioni di riferimento di aflatossina B1 protette dalla luce usando fiale ambrate o comunque. avvolte in foglio di alluminio, 2 3 L uso di vetreria nuova non trattata con acidi fiale provette ecc nella preparazione delle.
soluzioni di lavoro del materiale di riferimento certificato di aflatossina B1 o durante l analisi dei. campioni pu causare una perdita della micotossina Pertanto Prima dell uso la vetreria nuova. dovr essere immersa in acido diluito acido solforico 2 mol L per 5 6 ore e risciacquata con. acqua distillata per rimuovere tutte le tracce di acido controllare usando un indicatore di pH Ad. ogni modo fortemente raccomandato l uso di vetreria silanizzata per la quale non necessario. effettuare il pretrattamento con acido,3 RIFERIMENTI NORMATIVI E BIBLIOGRAFICI. 3 1 Regolamento CE N 1881 2006 della Commissione che definisce i tenori massimi di alcuni. contaminanti nei prodotti alimentari Gazzetta ufficiale dell Unione europea L 364 5. 3 2 Regolamento CE N 401 2006 della Commissione relativo ai metodi di campionamento e di. analisi per il controllo ufficiale dei tenori di micotossine nei prodotti alimentari Gazzetta ufficiale. dell Unione europea L 70 12, 3 3 Stroka J von Holst C Anklam E Immunoaffinity column clean up with liquid chromatography. using post column bromination for determination of aflatoxin B1 in cattle feed collaborative. study Journal of AOAC International vol 86 6 2003, 3 4 ISO 3696 1987 Acqua di qualit analitica Specifiche e metodi di prova. 3 5 Castegnaro M Barek J Fremy J M Lafontaine M Miraglia M Sansone E B Telling G M. Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes some. mycotoxins IARC Scientific Publication No 113 International Agency for Research on Cancer. Lyon France 1991,Pag 3di 14, E vietata la riproduzione anche parziale del presente documento. 4 PRINCIPIO DEL METODO, La aflatossina B1 viene estratta dalla matrice omogeneizzando il campione con una soluzione.
idroalcoolica si effettua poi una diluizione dell estratto mediante aggiunta di una soluzione tampone a. ali di fosfato PBS La purificazione viene effettuata mediante passaggio su colonnina di. immunoaffinit IAC contenente anticorpi specifici per la AFB1 la micotossina viene quindi eluita con. metanolo e quantificata tramite HPLC a fase inversa con rivelazione spettrofluorimetrica preceduta da. derivatizzazione post colonna,5 REAGENTI E MATERIALE DI RIFERIMENTO. Durante l analisi a meno che non sia diversamente specificato usare solo reagenti di grado analitico. riconosciuto e solo acqua distillata o acqua di grado 1 come definito in EN ISO 3696 I solventi. dovrebbero essere di purezza per analisi HPLC Possono essere usate soluzioni commerciali di propriet. equivalenti a quelle menzionate,5 1 Acqua deionizzata. 5 2 Acetonitrile per HPLC,5 3 Metanolo per HPLC,5 4 Metanolo per analisi. 5 5 Cloruro di potassio KCl,5 6 Cloruro di sodio NaCl. 5 7 Disodio idrogeno fosfato biidrato Na2HPO4 2H2O. 5 8 Acido cloridrico 0 1 mol L,5 9 Idrossido di sodio 0 1 mol L.
5 10 Tampone fosfato concentrato PBS Phosphate Buffered Saline concentrato. Sciogliere in 1800 mL di acqua 4 0 g di KCl 5 5 160 0 g di NaCl 6 6 36 0 g di disodio idrogeno. fosfato biidrato Na2HPO4 2H2O 5 7 Portare il pH della soluzione a 7 4 con acido cloridrico 0 1. mol L 5 8 o con idrossido di sodio 0 1 mol L 5 9 secondo necessit Il volume finale della soluzione. deve essere portato a 2 litri con acqua, 5 11 Tampone fosfato diluito PBS Phosphate Buffered Saline diluito. Prelevare 100 mL di PBS concentrato 5 10 e portare a un litro con acqua. 5 12 Fase mobile per analisi HPLC, Miscelare acqua 5 1 metanolo 5 3 acetonitrile 5 2 nelle proporzioni 54 29 17 v v v. 5 13 Solvente di estrazione, Miscelare metanolo 5 4 acqua 5 1 nelle proporzioni 80 20 v v. 5 14 Soluzione derivatizzante, Soluzione acquosa di PBPB 0 05 g L pyridinium hydrobromide perbromide CAS N 39416 48 3. 5 15 Solvente di iniezione, Miscelare metanolo 5 3 acqua 5 1 nelle proporzioni 40 60 v v.
5 16 Materiale di riferimento certificato di AFB1 in soluzione. Utilizzare il materiale di riferimento certificato in soluzione commercialmente disponibile La soluzione. deve avere una concentrazione di circa 2 g mL di tossina. 5 17 Soluzione di lavoro del materiale di riferimento certificato di AFB1. Pag 4di 14, E vietata la riproduzione anche parziale del presente documento. Preparare una soluzione che abbia una concentrazione finale di circa 100 ng mL pipettando 250 L. della soluzione 5 16 e portando a volume in un matraccio da 5 mL con il solvente di iniezione 5 15. 5 18 Materiale di riferimento certificato di controllo di AFB1. Da un materiale di riferimento certificato indipendente da quello indicato in 5 16 preparare una. soluzione che abbia una concentrazione di circa 100 ng mL con le stesse modalit indicate nel. paragrafo 5 17,6 APPARECCHIATURE E MATERIALI, Attrezzature correnti di laboratorio e in particolare le seguenti. 6 1 Bilancia analitica accurata sui 0 01 mg,6 2 Bilancia tecnica accurata sui 0 1 g. 6 3 Omogeneizzatore tipo Ultra Turrax e o Blender con capacit di almeno 1 L dotati di coperchio. funzionanti ad alta velocit, 6 4 Vortex per l agitazione e la miscelazione delle soluzioni nelle vials. 6 5 Macinino,6 6 Filtro di carta,6 7 Filtro microfibra di vetro.
6 8 Pipette micropipette e puntali per prelevare volumi 10 mL 5 mL 1 mL e 200 L. 6 9 Sistema HPLC composto da, 6 9 1 Sistema di iniezione valvola di iniezione loop da almeno 150 L. 6 9 2 Pompa HPLC capace di mantenere una velocit di flusso pari 1 mL min. 6 9 3 Fornetto riscaldante per colonna capace di mantenere una temperatura costante e g 40 C. 6 9 4 Colonna cromatografica C18 4 6 mm x 250 mm 5 m o che fornisca analoghe prestazioni. 6 9 5 Pompa per derivatizzazione post colonna capace di mantenere una velocit di flusso pari 0 4. 6 9 6 Rivelatore spettrofluorimetrico munito di cella a flusso e regolato a 365 nm di. eccitazione e 435 nm di emissione,6 9 7 Software di elaborazione dati. 6 10 Colonnine di immunoaffinit, Le colonnine di immunoaffinit devono contenere anticorpi specifici per la aflatossina B1. 6 11 Vacuum manifold per alloggiare le colonnine di immunoaffinit. 6 12 Siringhe monouso 5 mL 10 mL 50 mL o simili e raccordi per le colonnine di. immunoaffinit,Pag 5di 14, E vietata la riproduzione anche parziale del presente documento. 7 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE, Macinare il campione con un macinino 7 5 e miscelare bene prima di prelevare il campione di analisi.
Se il campione risultasse congelato e o sottoforma di slurry si deve procedere all analisi solo dopo. completo scongelamento,8 PROCEDURA, L esecuzione della prova prevede l analisi in doppio del campione oggetto di revisione Poich il. risultato dell analisi deve essere accompagnato da un dato di esattezza necessario lavorare. contestualmente al campione di revisione un opportuno campione ad esempio un bianco o un. naturalmente contaminato e uno spike oppure un materiale di riferimento certificato L esecuzione. della prova deve sempre prevedere l analisi di un campione di controllo. 8 1 Estrazione, Pesare direttamente nell omogeneizzatore 6 3 50 0 g di campione accuratezza 0 1 g Aggiungere. 5 0 g di cloruro di sodio 5 6 e 250 mL di solvente di estrazione 5 13 Chiudere il coperchio. dell omogeneizzatore ed agitare ad alta velocit il campione per 3 minuti Evitare di surriscaldare. l omogeneizzatore durante l estrazione ad alta velocit. Filtrare l estratto su filtro di carta 6 6 Prelevare 20 mL di filtrato e diluirli con 20 mL di PBS 5 11. fattore di diluizione D 2 Miscelare adeguatamente Filtrare nuovamente il campione su filtro a. microfibra di vetro 6 7 Applicare il campione diluito alla colonnina di immunoaffinit 6 10 come. descritto nella sezione successiva, 8 2 Purificazione passaggio in colonnina di immunoaffinit IAC. Preparare la colonnina di immunoaffinit 6 10 secondo le istruzioni del fornitore Collegare la. colonnina di immunoaffinit al vacuum manifold 6 11 e attaccare la siringa 6 12 alla IAC. Pipettare 20 mL di estratto diluito equivalente a 2 0 grammi di campione nella siringa trasferendoli in. IAC ad una velocit di flusso di circa 3 mL min applicando un vuoto moderato o utilizzando sistemi. equivalenti il flusso comunque non deve eccedere i 5 mL min. Fare attenzione a non mandare a secco la IAC durante il passaggio del campione. Lavare la IAC con 10 mL di acqua alla fine del passaggio del campione Asciugare la colonnina. passando almeno 2 volumi di aria,8 3 Preparazione della soluzione test. Eluire direttamente in matraccio da 5 mL la aflatossina B1 seguendo una procedura in due fasi. applicare 1 mL di metanolo 5 3 alla IAC e lasciarlo fluire per gravit. aspettare 1 minuto ed applicare una seconda porzione di 1 mL di metanolo 5 3. Raccogliere il solvente di eluizione residuo passando con una siringa da 10 mL attraverso la IAC un. volume d aria pari a due tre volte il volume della stessa Portare a volume in un matraccio da 5 mL. aggiungendo acqua 5 1 miscelare adeguatamente al vortex 6 4 e conservare il campione a 4 C fino. all analisi in HPLC,8 4 Derivatizzazione, La aflatossina B1 viene derivatizzata post colonna in una camera di reazione mediante una soluzione.
acquosa di PBPB 5 14 pyridinium hydrobromide perbromide 0 05 g L erogata da una pompa. derivatizzante 6 9 5 ad un flusso di 0 4 mL min,Pag 6di 14. E vietata la riproduzione anche parziale del presente documento. 9 PROCEDURA DI SPIKING, Pesare direttamente nell omogeneizzatore 6 3 50 g di campione accuratezza 0 1g non contaminato. bianco di mais mangime Pipettare nel campione bianco appropriati volumi della soluzione di lavoro. del materiale di riferimento di aflatossina B1 5 17 Lasciare sotto cappa il campione fortificato per. almeno 2 ore procedere poi come indicato al punto 8. Nel caso non fosse disponibile un campione bianco sar possibile effettuare lo spike fortificando un. campione naturalmente contaminato,Il recupero viene calcolato come segue. Re cupero 100, Ct concentrazione ottenuta dal campione fortificato g kg. Cs concentrazione ottenuta dal campione non fortificato nel caso del campione bianco Cs 0 g kg. Ca concentrazione di analita aggiunta g kg, I valori di recupero percentuale devono essere il pi possibile prossimi a 100 e comunque contenuti.
all interno degli intervalli ritenuti accettabili secondo il Regolamento CE N 401 2006. 10 ANALISI HPLC,10 1 Preparazione delle soluzioni di taratura. Preparare le soluzioni di taratura in matracci da 10 mL o 5 mL Diluire le soluzioni di taratura fino al. segno del menisco del matraccio con il solvente di iniezione 5 15 In tabella 1 sono riportati a titolo di. esempio i volumi di soluzione di lavoro del materiale di riferimento certificato di aflatossina B1 5 17. e di solvente di iniezione per la preparazione di soluzioni di taratura. Tabella 1 Preparazione delle soluzioni di taratura. Soluzione di Solvente di iniezione Soluzione Concentrazione Contaminazione. taratura no 6 15 L 6 17 della soluzione corrispondente. L ng mL g kg,1 9998 2 0 02 0 05,2 9980 20 0 20 0 50. 3 9960 40 0 40 1 00,4 9920 80 0 80 2 00,5 9800 200 2 00 5 00. 6 9760 240 2 40 6 00, Le soluzioni di taratura cos preparate opportunamente conservate a 4 C e protette dalla luce diretta. possono essere utilizzate per un massimo di sei mesi se i controlli previsti rispettano i criteri stabiliti. 10 2 Preparazione della soluzione del materiale di riferimento di controllo. La soluzione di materiale di riferimento di controllo viene preparata con una soluzione certificata. indipendente dalle soluzioni di taratura Preparare dalla soluzione ottenuta in 5 18 una soluzione che. abbia una concentrazione finale di circa 0 80 ng mL seguendo le indica. INDICE 1 SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE 3 2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI 3 La presente procedura specifica il metodo per la determinazione della aflatossina B 1

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